自从与三个可爱的小女孩Margo(Miranda Cosgrove饰)、Edith(Dana Gaier饰)和Agrace(Elsie Fisher饰)的命运相遇后,前反派Gru(Steve Carell饰)彻底改变了,相反,他变成了一个善良可亲的父亲和一个做腐烂布丁和果冻的商人。当然,没有什么是完美的,在这段时间里,他的老搭档纳法里奥博士(由拉塞尔·布兰德配音)离开了他,开始了新的职业生涯。一天,格鲁被一个名叫露西·王尔德(Kristen Wiig配音)的技术娴熟但鲁莽的特工绑架。事实证明,露西的团队已经开发出了可以改变生物基因的药物,但他们在南极洲的实验室被神秘的小偷偷走了,所以有恶棍经验的格鲁被委托为卧底。经过一番考虑,格鲁接受了这项任务,并与露西以及可爱的小黄人组成了一个搞笑的追击伙伴
严刑拷打并未使拜一刀屈服,反而使酉藏受到震撼。酉藏的主人三浦带刀(滨村纯 饰)因此拜托拜一刀刺杀其仇人猿渡玄蕃(山形勋 饰)。 另一方面,得知消息得猿渡召集数百人兵马围杀拜一刀父子,父子俩与猿渡的军团在地藏原展开殊死拚杀……